作者Evil Genius今天我们继续更新分子动力学的内容还是那句话要学就好好学争取学会不学就算了好好玩一玩有个好心态千万不要半学不学。就和种地一样要种就好好种不种就算了结果不会和大家开玩笑。参考文章知识积累TGFβ的背景转化生长因子-βTGFβ是一种强效细胞因子能调控细胞行为的各个方面。分泌与复合物形式TGFβ在分泌时与其前结构域及潜在TGFβ结合蛋白-1LTBP1共同形成大型潜在复合物LLC。激活机制该复合物通过与细胞外基质相互作用使得整合素介导的TGFβ激活成为可能。研究空白虽然TGFβ的结构已知但LTBP1如何影响TGFβ的结构和活性此前并不清楚。核心发现本研究利用冷冻电镜解析了LLC结构首次揭示了TGFβ与LTBP1八半胱氨酸结构域之间的一个疏水结合界面。功能验证基于结构指导的突变实验证明该疏水界面对于复合物的形成以及TGFβ的生物学活性都至关重要。结构特征LLC采用对侧结构域交换的构型这种构型使得整合素介导的激活需要更大的外力才能启动。力学调控机制TGFβ与LTBP1之间的共价连接能够重新分配受力反而降低了TGFβ去折叠所需的能垒从而在力学上调节了激活过程。研究意义这些结构和力学层面的新见解为未来设计靶向TGFβ的治疗策略如抗纤维化药物提供了重要的分子基础。TGFβ的基本特性与调控必要性TGFβ是多功能强效细胞因子调控增殖、分化、迁移等多种过程在发育、免疫和组织稳态中起关键作用其失调与自身免疫病、炎症、纤维化和癌症相关因此需要精密调控。TGFβ的合成与复合物形成TGFβ合成时带有LAP前结构域LAP经弗林蛋白酶切割后仍非共价结合TGFβ形成SLC。分泌前SLC与LTBP1二硫键连接形成LLC或在调节性T细胞和血小板中与GARP结合二者功能分工不同——GARP负责免疫调节LLC负责发育、伤口愈合和纤维化。LTBP家族与LTBP1的关键作用LTBP1、-3、-4可通过与LAP的Cys33形成二硫键结合TGFβLTBP1是最常见亚型对潜在TGFβ的分泌和细胞外基质储留至关重要。Cys33突变导致多器官炎症但程度轻于TGFβ完全敲除提示存在不依赖LTBP1的替代激活途径。TGFβ的激活机制主要生理激活途径是整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6介导的力激活需要LLC通过LTBP1锚定于细胞外基质以提供机械阻力诱导LAP构象变化释放活性TGFβ。αVβ8则可通过蛋白酶依赖或非依赖方式从SLC激活TGFβ机制不同。结构研究的进展与争议SLC晶体结构显示LAP环状环绕TGFβ但连接区未解析早期模型支持同侧排列近期GARP-SLC冷冻电镜结构显示对侧结构域交换构型。正确构型的确定对理解力如何从臂结构域传递到“紧身衣”至关重要。研究的核心发现解析了3.06 Å分辨率的LLC冷冻电镜结构明确了LTBP1的TB结构域与SLC的结合方式揭示了成熟TGFβ与LTBP1之间由π-π堆积支持的疏水界面该界面对共价复合物形成和TGFβ活性调控至关重要。对构型和力调控的新认识结构证实潜在TGFβ采用对侧结构域交换构型。模拟显示对侧构型中臂结构域“扣环”解扣所需的主要力屏障更大但LTBP1的共价连接能重新分配力降低去折叠的力屏障从力学上调控激活过程。治疗意义目前全局性抑制TGFβ信号的治疗毒性较大新型靶向策略如增强GARP复合物中TGFβ激活的单抗显示出前景。本研究对TGFβ潜伏和激活机制的深入理解有助于开发更具靶向性的治疗方法。结果1、LTBP1结合的潜在TGFβ复合物的冷冻电镜结构研究目的为阐明LTBP1介导TGFβ潜伏状态的分子结构基础。样品制备制备了SLC与LTBP1 C端区域共价连接的复合物并带有非共价结合的fibrillin-1 N端片段。结构解析通过冷冻电镜解析了SLC与LTBP1 TB2结构域的结构分辨率达到3.06 Å命名为LLC。未解析部分TB2下游的LTBP1结构域密度微弱fibrillin-1未被解析推测是由于这些结构域具有柔性。结构特征LLC保留SLC的环状结构但LAP“紧身衣”的α1螺旋向下延伸与LTBP1的TB2共价连接该连接偏移至二聚体一侧打破了SLC的二重对称性。共价连接细节二硫键具体形成于LAP二聚体的两个Cys33残基与LTBP1的Cys1359和Cys1384之间。构型确认冷冻电镜密度图证实了LAP的“紧身衣”与臂结构域之间为对侧结构域交换的构型。结果2、大型潜在复合物揭示了成熟TGFβ生长因子与LTBP1之间的疏水界面并通过π-π堆积相互作用得以加强核心发现LLC中成熟TGFβ生长因子与LTBP1的TB2结构域之间存在一个疏水界面。具体相互作用TGFβ的328–333位残基与LTBP1的1386–1391位残基之间形成连续的反向平行β-折叠片。疏水斑块该区域含有多个溶剂暴露的疏水残基在两个分子表面分别形成疏水斑块。稳定机制疏水相互作用由π-π堆积TGFβ的Y328/W330与LTBP1的W1380/F1387之间和氢键网络进一步稳定。结构重排TGFβ的334–338位残基在先前SLC结构中为未解析的柔性环但在LLC结构中折叠成两亲性螺旋段336–343位残基位于SLC底部。共同特征这种有序化现象与GARP-SLC结构中的情况相似表明无论是与LTBP1还是GARP形成潜在复合物该区域的有序化是一个共同的结构特征。结果3、TGFβ与LTBP1之间的疏水π-π堆积相互作用对共价复合物的形成及TGFβ活性的调控至关重要研究假设TGFβ与LTBP1之间的非共价相互作用对LLC共价复合物的形成和TGFβ激活调控可能很重要。实验设计将参与π-π堆积的芳香族残基TGFβ的Y328和W330LTBP1的W1380和F1387分别及同时突变为丙氨酸转染HEK293细胞检测LLC形成能力。关键结果——完全阻断LLC形成的突变LTBP1 W1380A、TGFβ Y328A以及双突变DM均完全阻止了共价LLC的形成。关键结果——部分保留LLC形成的突变LTBP1 F1387A突变体保留野生型43.85%的LLC形成水平TGFβ W330A突变体保留野生型21.87%的水平。特异性验证所有突变均不影响SLC和LTBP1本身的折叠或分泌突变仅特异性地影响LLC共价复合物的形成能力。活性测定结果LTBP1 F1387A突变的LLC活性与野生型无显著差异但TGFβ W330A突变的LLC活性显著高于野生型。结论LTBP1与TGFβ界面中的芳香族残基对LLC形成至关重要该区域的失稳可能暴露成熟TGFβ使其更易被激活。结果4、LTBP1与SLC的结合不改变其对αvβ6的亲和力结构差异在LLC结构中LAP的RGD区域为未被解析的柔性环而此前SLC结构中该区域可被解析。结构相似性LTBP1潜在复合物中RGD环的这种柔性排列与GARP-SLC潜在复合物中的情况相似。研究问题欲验证LTBP1是否通过增强整合素结合亲和力来促进TGFβ激活。实验方法使用Octet生物层干涉测量BLI技术比较LLC和SLC与整合素αVβ6头部的结合亲和力。核心结果动力学分析显示LLC与SLC在与αVβ6的结合量及亲和力上均无显著差异。结论SLC与LTBP1的结合并不改变其与整合素αVβ6的相互作用即LLC中TGFβ潜伏状态的维持并非通过降低整合素结合亲和力来实现。结果5、比较同侧与对侧排列TGFβ力介导激活的分子动力学模拟结构背景LLC冷冻电镜结构支持潜在TGFβ采用对侧结构域交换构型“紧身衣”与臂结构域在分子相对两侧这与GARP-SLC冷冻电镜结构一致但与早期X射线晶体学提出的同侧模型相反。研究问题“紧身衣”与臂结构域的排列方式可能影响整合素介导激活所需的力屏障但此前模拟均基于同侧构型对侧构型的影响未知。实验方法采用力探针分子动力学模拟以0.05 nm/ns的速度牵拉整合素β6杂交结构域的质心阻力由LAP Cys33提供分别构建同侧和对侧连接环区进行比较。同侧模拟结果重现了Dong等人报道的结果显示四个关键力屏障——依次为两个臂结构域“扣环”解扣随后是两个“紧身衣”α2螺旋依次解旋。LAP臂结构域的特殊性与其他TGFβ超家族成员不同LAP的两个臂结构域通过蝴蝶结基序的二硫键相连导致牵拉力可在两个臂结构域之间传递。对侧模拟结果——相似之处LAP去折叠事件的顺序和TGFβ释放所需的总能量与同侧构型基本相似。对侧模拟结果——关键差异对侧排列需要更大的力才能克服主要力屏障即整合素结合的LAP“扣环”解扣这一步。结果6、力探针分子动力学模拟揭示LTBP1在LLC中抵抗力的贡献研究目的探究LAP与LTBP1的共价连接是否改变LAP的去折叠事件和TGFβ释放所需的力。模拟方法与之前类似但阻力点从LAP的半胱氨酸残基改为LTBP1 TB2结构域的质心牵拉速度仍为0.05 nm/ns。核心发现——LLC更易激活施加力后LLC比SLC更易于被激活所需牵拉距离更短、力更小。原因解释LTBP1 TB2结构域的连接对LAP施加了额外约束使LAP结构无法完全松弛“扣环”与生长因子的结合相对不稳定因此更容易断裂。力屏障数量减少当力通过TB2结构域施加时LLC中整合素介导的LAP去折叠的主要力屏障较少。LTBP1的力学调节作用LTBP1 TB2结构域充当力调节器使力在两个LAP链之间更均匀地分布更有效地协调解扣和解离事件。去折叠事件顺序的差异SLC模拟α1螺旋先解旋 → 整合素结合的“扣环”解扣 → 非整合素结合的“扣环”解扣 → 整合素结合的α2解旋 → 非整合素结合的α2解旋。LLC模拟α1螺旋解旋大幅延迟且多个事件协同发生整合素结合的α1解旋与多种事件同时发生非整合素结合的“扣环”解扣与整合素结合的α2解旋同时发生。协同机制的意义这种协同解旋模式表明LTBP1的共价连接能协调力依赖事件更有效地将力传递到LAP的上游结构元件潜伏套索、α2螺旋和“扣环”从而促进TGFβ的释放。最后来看看方法动力学模拟生活很好有你更好。