一、技术概述在单个细胞的水平之上, 捕获mRNA, 构建文库, 并且进行高通量测序, 以此解析细胞基因表达谱, 这一技术被称作单细胞转录组测序, 它突破了传统bulk测序“细胞群体平均信号”的局限, 能够区分细胞异质性, 鉴定稀有细胞, 解析细胞分群/分化轨迹, 挖掘标记基因, 在肿瘤、免疫、发育生物学、神经科学、疾病机理等领域有着广泛应用。将组织或细胞悬液拆分为单个细胞, 此为核心原理中的单细胞分离利用 poly (dT) 探针结合 mRNA 的 polyA 尾, 同时引入细胞条形码、分子标签, 这是细胞裂解加 mRNA 捕获之后进行反转录、cDNA 扩增、文库构建、上机测序基于 UMI 去冗余, 定量单细胞基因表达, 后续做分群、功能解析, 这属于生信分析。二、实验的流程是这样的, 其中湿实验: 其一, 样本的制备, 这可是最为关键的步骤, 它直接地决定了数据品质其二, 进行建库以及测序。其三, 标准的生物信息学的分析流程, 也就是干实验。分成基础分析, 以及高级分析, 行业当中主流的软件是, Cell 10× 官方加上 /。一第一步, 进行原始数据质控以及表达矩阵构建, 对于Cell测序数据要进行拆分, 而后将其比对到参考基因组。基于UMI统计信息, 从而生成基因 - 细胞表达矩阵, 其中行代表基因, 列代表细胞。还要开展初步过滤工作, 即去除空油滴以及低质量假细胞。二第二步细胞水平质控QC/过滤不合格细胞指标如下可进行检测的基因数量, 若数值过低, 出现的情况是细胞破损以及mRNA流失要是数值过高, 则会有多细胞粘连的状况常规的阈值范围是200至6000个基因每细胞依据物种以及样本进行微调。UMI的总数所代表的含义是总转录本数, 其与基因数呈现出一致的趋势。线粒体基因的比例.mt, 比例高意味着细胞凋亡或者破损常规阈值是线粒体基因占比小于10%处于应激状态的细胞可放宽至15%。需要去除的是双细胞也就是两个细胞被同一个油滴捕获, 有 、 等工具得以剔除。三接着第三步: 先是数据标准化, 再进行降维聚类标准化, 这里面包括全局归一化、对数转换, 以此来消除测序深度差异然后是高可变基因筛选, 要挑选出表达变异大的基因, 也就是主导细胞异质性的那部分基因, 用于后续的分析之后是降维PCA, 也就是主成分分析, 进行线性降维, 把噪音去除再有UMAP / t-SNE, 进行非线性降维, 用来可视化细胞分群, 其中UMAP目前是首选, 它能保留全局结构最后是细胞聚类, 依据PCA距离对细胞进行分群, 从而得到0、1、2… 等不一样的细胞亚群。四第四步: 亚群注释, 这是核心环节。给聚类得到的未知细胞群定义细胞类型两种方式结合选取标记基因作分析, 进行差异分析, 比如 t 检验等, 以此找出每个亚群里特异性高表达的基因。针对细胞类型注释, 有手动注释方式, 也就是结合文献以及已知的经典基因来判断, 像免疫细胞、上皮细胞、基质细胞、神经元等还有自动注释方式, 是参考数据库, 如 Human Cell Atlas、Mouse Cell Atlas 等来匹配注释。五第五步常规可视化六第六步功能富集分析针对亚群 基因集做功能解析GO富集, 涉及生物过程BP、细胞组分CC、分子功能MF这几方面KEGG通路包含信号通路、代谢通路GSEA是基因集富集以判断通路整体处于激活还是抑制状态疾病相关有DO等疾病数据库注释。七第七步为高级进阶分析。根据研究选题选择性开展细胞轨迹分析也就是拟时序分析, 它能干的是推断细胞分化或者演化路径, 主流工具里有PAGA, 它常常被用于发育、干细胞以及肿瘤演进方面。细胞通讯分析呢, 分析的是不同细胞亚群之间配体与受体的互作 , 目的是解析微环境细胞间的信号交流工具包括iTALK等。差异分析是分析组间, 像正常对比疾病、处理对比对照这样的情况, 看整体或者特定亚群的差异基因。转录因子分析则是挖掘关键调控TF, 工具也有相应的。依据未剪接与剪接mRNA比例, 可变剪接、RNA速度可预测细胞未来分化方向, 多样本、多批次数据整合批次校正以及单细胞与空间转录组的联合分析还能被整合分析。四、关乎常见问题以及实验时需留意的注意事项, 其一为实验端所出现的问题, 其二是数据分析过程里常见的诸多坑, 五、存在应用场景的举例情况, 于肿瘤研究方面, 要解析肿瘤微环境以及肿瘤干细胞, 还有浸润免疫细胞的亚型以及耐药细胞群, 在免疫研究领域, 需关注免疫细胞的分群, 以及活化或者耗竭状态, 还有免疫应答机制, 对于发育生物学而言, 涉及胚胎发育以及器官发育, 还有细胞分化轨迹, 在疾病机制层面, 要进行筛选疾病特异性细胞亚群, 以及致病关键基因与通路的工作, 于药物研发范畴, 是定位药物作用的细胞, 并且解析药物响应或者耐药机制。六、有常用工具的汇总情况。